摘 要： 目的 探討刺五加腦靈膠囊對(duì)氯化鋁致癡呆小鼠的保護(hù)作用。方法將60只SPF級(jí)昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、刺五加腦靈膠囊高、中、低劑量 (1.01、0.33、0.10 g/kg) 組。采用腹腔注射三氯化鋁建立阿爾茨海默病 (AD) 小鼠模型。觀察刺五加腦靈膠囊對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、乙酰膽堿酯酶 (AchE) 、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶 (ChAT) 和β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 的影響。結(jié)果 刺五加腦靈膠囊高劑量組自主活動(dòng)次數(shù)顯著多于模型組;刺五加腦靈膠囊組上岸時(shí)間顯著縮短, 錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少;刺五加腦靈膠囊中、高劑量組小鼠腦組織Aβ含量顯著降低, AchE活性顯著降低, ChAT活性顯著增加 (均P<0.05) 。結(jié)論 刺五加腦靈膠囊能減少Aβ沉積, 增強(qiáng)ChAT活性同時(shí)降低AchE活性, 對(duì)氯化鋁致癡呆小鼠有一定的改善和保護(hù)作用。

阿爾茨海默病 (AD) 主要臨床特征是患者出現(xiàn)智力、記憶力、感覺定向的不可逆退化[1]。2010年世界AD患者大約有3 560萬, 預(yù)計(jì)到2050年, 世界AD患者的數(shù)量將達(dá)到1億1千萬, 其中中國(guó)AD患者將接近2 000萬[2,3]。中醫(yī)在養(yǎng)生保健、益智健腦方面有著豐富的理論、實(shí)踐經(jīng)驗(yàn), 為篩選中藥有效成分防治癡呆提供了基礎(chǔ)[4]。中藥刺五加為五加科植物, 味辛、微苦、性溫、無毒, 具有多種藥理作用和臨床應(yīng)用, 能益氣健脾、補(bǔ)腎安神[5]。而五味子中的主要成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有改善學(xué)習(xí)、記憶, 鎮(zhèn)靜, 催眠, 抗衰老的作用[6]。刺五加腦靈膠囊由刺五加浸膏和五味子流浸膏組成, 用于心脾兩虛、腎不足所致的健忘、心神不寧、失眠多夢(mèng)等。本研究觀察刺五加腦靈膠囊對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶、乙酰膽堿酯酶 (Ach E) 、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶 (Ch AT) 和β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)昆明種小鼠, 60只, 雌雄各半, 17~19 g (中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)提供) 。XZ-4小鼠自主活動(dòng)自動(dòng)控制記錄儀、LW-I小鼠水迷宮測(cè)試儀 (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所) ;臺(tái)式低速離心機(jī) (湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司) ;酶標(biāo)儀 (美國(guó)Thermo公司) 。刺五加腦靈膠囊 (山東仙河藥業(yè)有限公司) ;三氯化鋁 (北京市李遂化工廠) ;Aβ、Ch AT、Ach E檢測(cè)試劑盒 (南京建成生物工程研究所) 。

1.2 分組及給藥

將60只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、刺五加腦靈膠囊高、中、低劑量 (1.01、0.33、0.10 g/kg) 組。刺五加腦靈膠囊組灌胃給予相應(yīng)藥物, 模型組和正常對(duì)照組灌胃給予同體積生理鹽水, 連續(xù)58 d。

1.3 建立AD小鼠模型

所有造模動(dòng)物從給藥后第5天開始隔日1次腹腔注射三氯化鋁100 mg/kg (0.1 ml/10 g) 造模, 正常對(duì)照組腹腔注射同體積生理鹽水, 連續(xù)50 d。

1.4 行為學(xué)測(cè)試

造模第51天, 小鼠灌胃給藥后1 h, 放入XZ-4小鼠自主活動(dòng)計(jì)數(shù)儀中, 穩(wěn)定5 min后, 記錄小鼠5 min內(nèi)活動(dòng)數(shù)。造模第53天, 于暗室中將LW-I水迷宮自動(dòng)控制記錄儀通電, 放水, 水溫20℃~21℃, 室溫20℃。小鼠灌胃給藥后1 h, 放入水迷宮中訓(xùn)練A點(diǎn)1次, 最長(zhǎng)上岸時(shí)間以2 min為止。2 h后再訓(xùn)練A點(diǎn)1次, 記錄上岸時(shí)間和回頭錯(cuò)誤次數(shù);再4 h后放入B點(diǎn), 記錄小鼠上岸時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù), 上岸時(shí)間最長(zhǎng)以2 min計(jì)。造模第54天, 將已訓(xùn)練小鼠放入水迷宮B點(diǎn), 測(cè)定上岸時(shí)間和回頭錯(cuò)誤次數(shù), 上岸時(shí)間最長(zhǎng)以2 min計(jì)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

58 d灌胃給藥結(jié)束后, 斷頭處死大鼠, 迅速取出腦組織, 置于冰盒上, 分離海馬并稱重。按照1∶10 (W∶V) 的比例加入冰生理鹽水勻漿, 3 000 r/min離心10 min, 取上清液待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒說明書測(cè)定腦組織中Aβ含量、Ch AT、Ach E兩種酶的活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用軟件行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 刺五加腦靈膠囊對(duì)AD小鼠自主活動(dòng)的影響

表1可見, 模型組小鼠自主活動(dòng)數(shù)量顯著少于正常對(duì)照組 (P<0.01) , 刺五加腦靈膠囊高劑量組自主活動(dòng)次數(shù)顯著多于模型組 (P<0.05) 。各組小鼠體重差異不明顯 (P>0.05) 。

表1 各組自主活動(dòng)、體重比較 (n=12, ±s)

2.2 刺五加腦靈膠囊對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

造模后, 模型組與正常對(duì)照組比較水迷宮試驗(yàn)各點(diǎn)訓(xùn)練和測(cè)試的上岸時(shí)間均延長(zhǎng), 錯(cuò)誤次數(shù)均增多 (均P<0.01) 。刺五加腦靈膠囊高劑量組第2天測(cè)試的B點(diǎn)上岸時(shí)間顯著縮短, 低、中、高劑量組錯(cuò)誤次數(shù)都顯著減少 (P<0.05, P<0.01) 。見表2。

2.3 刺五加腦靈膠囊對(duì)AD小鼠海馬組織Aβ、Ch AT、Ach E的影響

模型組小鼠海馬組織Aβ含量顯著高于正常對(duì)照組 (均P<0.01) , Ch AT活性顯著低于正常對(duì)照組, Ach E活性顯著高于正常對(duì)照組。與模型組比較, 刺五加腦靈膠囊中、高劑量組小鼠海馬組織Aβ含量顯著降低, Ch AT活性顯著增加, Ach E活性顯著降低 (P<0.05, P<0.01) 。見表2。

表2 各組學(xué)習(xí)記憶、海馬組織Aβ、Ch AT、Ach E的影響 (n=12, ±s)

3 討論

鋁可導(dǎo)致腦組織神經(jīng)元纖維纏結(jié)和老年斑的形成[7]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn), 飲用水含鋁量高的地區(qū), AD的發(fā)病率較高, 為其他地區(qū)的1.5~2.7倍[8]。同時(shí), 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明, 鋁在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的沉積可明顯抑制學(xué)習(xí)記憶功能, 使動(dòng)物出現(xiàn)AD的特征性病理改變[9]。本研究顯示刺五加腦靈膠囊有較好的改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。AD是多病因相互作用的結(jié)果, 其中, 老年斑主要是由具有神經(jīng)毒性和血管毒性的Aβ生成, 同時(shí), Aβ沉積又可導(dǎo)致突觸和神經(jīng)棘缺失, 嚴(yán)重影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能, 最終造成大腦學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力損傷[10]。在正常生理狀態(tài)下, 大腦僅表達(dá)少量的Aβ, 低濃度的Aβ可營(yíng)養(yǎng)未分化、不成熟的神經(jīng)元;而在AD大腦中Aβ則大量表達(dá), 高濃度的Aβ能損傷已分化、成熟的神經(jīng)元[11]。Aβ沉積可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞, 促進(jìn)其釋放促炎因子和一氧化氮, 從而引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12];聚集的Aβ可引起神經(jīng)元反應(yīng)性活性氧增高, 造成神經(jīng)元氧化損傷;可破壞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡[13];還可改變線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能, 進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[14]。Ach E的作用是分解乙酰膽堿, 與Ch AT共同調(diào)節(jié)乙酰膽堿的動(dòng)態(tài)平衡[15]。同時(shí), Ach E作為乙酰膽堿的水解酶, 其變化一般晚于Ch AT, 因此在AD發(fā)病初期, 由于Ch AT異常所致合成減少的乙酰膽堿, 仍被正常的Ach E分解, 致使突觸間乙酰膽堿含量的減少[16]。Aβ沉積會(huì)增加Ach E表達(dá), 在AD患者大腦老年斑和膽堿能神經(jīng)元丟失區(qū)域內(nèi)Ach E活性顯著升高, 造成乙酰膽堿異常。Ach E又能促進(jìn)Aβ生成, 加速其聚積[17], 進(jìn)而形成一種惡性循環(huán)。

綜上所述, 在AD的發(fā)病機(jī)制中膽堿能神經(jīng)異常及Aβ毒性在其發(fā)病中占有重要作用。到目前為止, 美國(guó)FDA認(rèn)可上市的治療AD的藥物主要是Ach E抑制劑, 即通過降低Ach E的活性提高大腦中Ach E的含量, 進(jìn)而改善神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的學(xué)習(xí)和記憶功能的下降[18]。因此, 探尋毒副作用小而功效作用強(qiáng)的Ach E抑制劑, 是研究防治AD藥物的有效途徑之一。本研究提示刺五加腦靈膠囊能夠通過減少Aβ沉積, 增加Ch AT活性, 降低Ach E活性, 改善小鼠海馬膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能, 達(dá)到防治AD的作用。但是, 由于刺五加腦靈膠囊成分復(fù)雜, 其確切地改善學(xué)習(xí)記憶能力的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚, 且其調(diào)節(jié)AD的具體分子機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明。

參考文獻(xiàn)

[1] Houmani N, Vialatte FB, Latchoumane C, et al.Stationary epoch-based entropy estimation for early diagnosis of Alzheimer’s disease[J].ICIP, 2013;302:1241-4.

[2] Prince M, Bryce R, Albanese E, et al.The global prevalence of dementia:a systematic review and metaanalysis[J].Alzheimers Dement, 2013;9 (1) :63-75.

[3]王晶.我國(guó)阿爾茨海默病的流行現(xiàn)狀及預(yù)防措施[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2011;7 (2) :157-8.

[4]陳新梅.抗老年癡呆藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2011;20 (3) :30.

[5]張茹, 李廷利, 劉曉巖.刺五加對(duì)睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬LTP的影響[J].中藥藥理與臨床, 2011;27 (1) :63-6.

[6]謝云亮.五味子有效成分分離純化及對(duì)記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué), 2013.

[7]尹學(xué)均.鋁與Alzheimer病[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生分冊(cè), 1995;22 (4) :193-7.

[8]呂永貞, 張麗.老年癡呆的臨床分析與護(hù)理[J].工企醫(yī)刊, 2006;19 (2) :551.

[9]張忠賢, 孫秀發(fā), 朱清華.鋁與脂質(zhì)過氧化[J].國(guó)外醫(yī)學(xué) (衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)) , 1999;26 (4) :219-41.

[10]鄭博聞, 黃漢昌, 路書彥, 等.阿爾茨海默病理?xiàng)l件下突觸系統(tǒng)病變的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué), 2015;2:182-90.

[11] Atwood CS, Obrenovich ME, Liu T, et al.Amyloid-β:a chameleon walking in two worlds:a review of the trophic and toxic properties of amyloid-β[J].Brain Res Rev, 2003;43 (3) :1-16.

[12] Saha RN, Pahan K.Regulation of inducible nitric oxide synthase gene in glial cells[J].Antioxid Redox Signal, 2006;8 (5-6) :929-47.

[13]黃漢昌, 姜瑞瑞, 林婧, 等.阿爾茨海默病發(fā)生機(jī)制及其治療藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志, 2011;31 (15) :2993-7.

[14]武福軍, 詹永樂, 朱飛奇.線粒體變化機(jī)制與阿爾茨海默病[J].中國(guó)老年學(xué)雜志, 2011;31 (2) :354-7.

[15]毛曉霞, 苗光新, 吳曉光, 等.山楂葉總黃酮對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬ACh E, Ch AT活性的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014;17:167-70.

[16]蒲亞嵐, 王永紅.阿爾茨海默病中樞膽堿能系統(tǒng)的損傷及主要機(jī)制[J].中國(guó)老年學(xué)雜志, 2010;30 (24) :3840-2.

[17] Jean L, Thomas B, Tahiri-Alaoui A, et al.Heterologous amyloid seeding:revisiting the role of acetylcholinesterase in Alzheimer's disease[J].PLo S One, 2007;2 (7) :e652.

[18] Huang Y, Mucke L.Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies[J].Cell, 2012;148 (6) :1204-22.

作者簡(jiǎn)介：孫雅煊 (1970-) , 女, 博士, 教授, 碩士生導(dǎo)師, 主要從事生物活性物質(zhì)的提取及生理功能研究。

作者簡(jiǎn)介：賈世亮 (1990-) , 男, 碩士, 主要從事生物活性物質(zhì)的生理功能研究。